dépannage de Western blot

Résolvez vos problèmes de Western blot avec ces conseils de dépannage, couvrant les causes courantes d'absence de signal, d'arrière-plan élevé, de bandes multiples, etc..

1. Pas de signal
2. Arrière-plan élevé.
3. Plusieurs bandes.
4. «Taches» blanches inégales sur la tache.
5. Points noirs sur la tache.
6. Bandes blanches sur une tache noire.
7. La voie du marqueur de poids moléculaire est noire.

1. Pourquoi mon Western blot ne fonctionne pas?
2. Pourquoi mon Western blot est-il étalé?
3. Vous lavez-vous après avoir bloqué le Western blot?
4. Quelles sont les causes de la liaison non spécifique dans le Western blot?
5. Comment puis-je améliorer mes résultats de Western Blot?
6. Pourquoi utilisons-nous du lait en Western blot?
7. Quelles sont les étapes du Western blot?
8. Pouvez-vous sur-transférer un Western blot?
9. Comment confirmez-vous le transfert des bandes de protéines du gel à la membrane dans le protocole Western Blot?
10. Combien de temps pouvez-vous bloquer un Western blot?
11. Pouvez-vous bloquer un Western blot pendant le week-end?
12. Combien de fois pouvez-vous dépouiller un Western blot?

Pourquoi mon Western blot ne fonctionne pas?

Si vous avez trop peu de protéines, si votre anticorps primaire n'a pas une affinité élevée ou si votre anticorps primaire est à une dilution sous-optimale, vous ne verrez pas votre protéine. Alternativement, si vous chargez trop de protéines, votre rapport signal sur bruit peut augmenter, ce qui rend la visualisation difficile..

Pourquoi mon Western blot est-il étalé?

Quelle est la raison d'un frottis dans un western blot? Comme vous pouvez le voir sur la coloration ponceau du transfert, il y a un frottis qui traverse les 7 premières voies. Les échantillons sont des cellules souches embryonnaires lysées par un tampon d'échantillon 2xLSB, pipetage et ébullition. ... Apparemment, le frottis est dû à un trop grand nombre de cellules dans un puits.

Vous lavez-vous après avoir bloqué le Western blot?

Le blocage est une étape très importante dans la phase d'immunodétection du transfert Western car il empêche la liaison non spécifique de l'anticorps à la membrane de transfert. Après le blocage, le transfert est rincé dans un tampon de lavage, généralement du TBST, avec une légère agitation et dans un volume suffisant pour maintenir le transfert submergé.. ...

Quelles sont les causes de la liaison non spécifique dans le Western blot?

L'une des causes les plus courantes de bandes non spécifiques est le blocage incomplet. Les tampons de blocage sont utilisés pour empêcher les anticorps primaires et secondaires de se lier à la membrane, ou à tout autre chose que la protéine d'intérêt.

Comment puis-je améliorer mes résultats de Western Blot?

Solution

1. Réduire la concentration d'anticorps primaires.
2. Diminuer la quantité de protéines totales chargées sur le gel.
3. Ajuster les conditions de blocage de la membrane.
4. Augmenter le nombre de lavages.
5. Vérifier la spécificité de l'anticorps.
6. Tamponnez avec l'anticorps secondaire seul.
7. Si des bandes se développent, choisissez un autre anticorps secondaire.

Pourquoi utilisons-nous du lait en Western blot?

Le blocage est une étape très importante du transfert de Western, car il empêche les anticorps de se lier à la membrane de manière non spécifique. Le blocage est souvent fait avec 5% de BSA ou du lait en poudre sans matière grasse dilué dans du TBST pour réduire le bruit de fond. ... L'anticorps peut être dilué dans un tampon de lavage, tel que PBS ou TBST.

Quelles sont les étapes du Western blot?

Cinq étapes sont impliquées dans la procédure de transfert Western et le test de détection, à savoir, le transfert, le blocage, l'incubation d'anticorps primaires, l'incubation d'anticorps secondaires et la détection de protéines, et l'analyse par transfert Western..

Pouvez-vous sur-transférer un Western blot?

Avec l'augmentation du temps, cependant, il existe un risque de transfert excessif (stripping, soufflage) des protéines à travers la membrane, en particulier pour les poids moléculaires inférieurs (<30 kDa) lors de l'utilisation de membranes avec une plus grande taille de pores (0,45 µm). Flux de travail d'électrotransfert humide / en réservoir de protéines pour le transfert de Western.

Comment confirmez-vous le transfert des bandes de protéines du gel à la membrane dans le protocole Western Blot?

Protocole de transfert de protéines

1. Préparer la membrane PVDF en la mouillant dans du méthanol pendant 30 secondes, puis en la trempant brièvement dans de l'eau distillée suivie d'un tampon de transfert 1X. ...
2. Faire tremper les papiers filtres et les éponges dans le tampon de transfert pendant 10 minutes avant l'assemblage du sandwich de transfert.

Combien de temps pouvez-vous bloquer un Western blot?

En général, le temps de blocage maximal ne doit pas dépasser 2 heures à température ambiante ou les protéines peuvent être échangées à partir de la membrane. Diluer l'anticorps primaire à la concentration / dilution recommandée dans une solution de blocage fraîche (TBS et / ou PBS (PBS Tablets 524650-1EA) / 3% de lait en poudre sans matière grasse).

Pouvez-vous bloquer un Western blot pendant le week-end?

Les anticorps à titre fort fonctionnent mieux avec une courte incubation et les anticorps faibles pour pneus nécessitent une incubation plus longue (à une concentration plus élevée). Laisser la tache dans le tampon de blocage pendant la nuit ou pendant le week-end à 4 ° C ne fait pas de mal.

Combien de fois pouvez-vous dépouiller un Western blot?

De plus, pendant que nous essayons d'éliminer les anticorps primaires, il est important de noter qu'il y a une probabilité que vous puissiez perdre une partie de la protéine que vous avez attachée ou transférée sur la membrane, il est donc conseillé de ne pas décaper la membrane plus d'une fois.